轉(zhuǎn)染可謂是做生物學實驗的大家經(jīng)常會考慮的一項實驗技術(shù)，大致原理也都是明白的。但是在實驗時經(jīng)常會遇到轉(zhuǎn)染效率太低，以至于無法進行后續(xù)的實驗。

到底轉(zhuǎn)染是什么呢？

為什么轉(zhuǎn)染效率不高呢？

其實

轉(zhuǎn)染，就是在真核細胞里導入具有生物功能的核酸，并在細胞中維持其生物功能。

轉(zhuǎn)染方法的選擇

我們熟知且常用的轉(zhuǎn)染方法主要有物理介導，化學介導，生物介導。

物理介導方法：電穿孔法、顯微注射和基因槍；

化學介導方法：如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術(shù)；

生物介導方法：有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)。

但實驗室使用較多的主要有化學介導中的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染）和生物介導中的慢病毒轉(zhuǎn)染法。其中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操作簡單，一般瞬時轉(zhuǎn)染選擇較多，但有些細胞系不容易轉(zhuǎn)染，因此選擇轉(zhuǎn)染方式時一定要做足功課，親身經(jīng)歷告訴我，千萬不要圖方便，否則轉(zhuǎn)染效率簡直崩潰。特別是養(yǎng)原代細胞的小伙伴，一點要認真選擇！病毒轉(zhuǎn)染一般具有能夠穩(wěn)定表達的優(yōu)勢，且其對原代細胞有較高的轉(zhuǎn)染效率，其中更分為慢病毒轉(zhuǎn)染，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染和腺病毒轉(zhuǎn)染，其中腺病毒轉(zhuǎn)染可適合更為難轉(zhuǎn)染的細胞，例如懸浮細胞、T細胞、raw細胞等難轉(zhuǎn)染細胞。

轉(zhuǎn)染的注意事項

01

有血清時的轉(zhuǎn)染

血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率，但只要在DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物形成時不含血清，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。

轉(zhuǎn)染過程在兩步中需要使用培養(yǎng)基做為稀釋液：在DNA-陽離子脂質(zhì)體復合物準備過程以及復合物同細胞接觸過程。

在開始準備DNA和陽離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基，因為血清會影響復合物的形成。但在復合物形成后，在加入細胞中前可以加入血清。

陽離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同，因此如果你想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對條件進行優(yōu)化。

大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康。對于對血清缺乏比較敏感的細胞，可以使用一些營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。

對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞，建議使用LIPOFECTAMINE 2000。

02

培養(yǎng)基中的抗生素

抗生素，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。

這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素，甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用抗生素。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。

對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。

大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化，這會導致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH 3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率，融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復最佳結(jié)果。

03

細胞狀態(tài)

細胞的生長狀態(tài)影響實驗結(jié)果，原代細胞和傳代次數(shù)多的細胞都不是*，處于對數(shù)生長期的細胞生長狀態(tài)最好，zui適合轉(zhuǎn)染。

同時，我們都知道細胞的密度不宜過大，大家往往注意的都是轉(zhuǎn)染前的密度，失敗過很多次的經(jīng)歷告訴大家，轉(zhuǎn)染后的細胞密度更加重要。

有時候轉(zhuǎn)染時間太久，等到進行后續(xù)實驗時細胞已經(jīng)肆意生長，漂起來了，豈不前功盡棄，流著眼淚也要告訴大家，考慮好細胞的生長周期和轉(zhuǎn)染的時間進行鋪板，建議選擇50%~80%區(qū)間密度進行細胞轉(zhuǎn)染。

04

細胞鋪板密度

用于轉(zhuǎn)染的最佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應用而異。

一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細胞密度為70%-90%，懸浮細胞密度為2×106-4×106細胞/ml時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。

鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。在三種不同密度進行細胞鋪板的比較表明鋪板密度最高的，CAT活性也最高。得到最高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應增加了。這些結(jié)果說明，對于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的最佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會因細胞密度而異。

05

啟動子的選擇

獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。

CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性，同其他啟動子，如SV40和RSV（勞斯肉瘤病毒）相比，在BHK-21中其活性最高。

這三種病毒啟動子在T細胞來源的細胞系，如Jurkat中組成表達水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細胞中CMV啟動子，而單PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白細胞）中的CMV啟動子。

SV40啟動子的表達在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）時會提高，因為大T抗原可以刺激染色體外的合成。

06

DNA量

高質(zhì)量的DNA對于進行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。以前研究者使用CsCl梯度離心得到的DNA進行轉(zhuǎn)染，但是這種方法費時費力。

其他的質(zhì)粒純化技術(shù)如Marligen的High Purity Plasmid Purification System使用*的陰離子交換樹脂純化DNA，可以得到用于轉(zhuǎn)染的高質(zhì)量DNA。

另外，Marligen的純化系統(tǒng)實驗步驟很簡單，可以在2小時內(nèi)完成。

07

瞬時和穩(wěn)定表達

DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達可以在1－4天內(nèi)檢測到。僅有一部分轉(zhuǎn)入細胞的DNA被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄并最終輸出mRNA到細胞質(zhì)進行蛋白合成。幾天內(nèi)，大部分外源DNA會被核酸酶降解或隨細胞分裂而稀釋；一周后就檢測不到其存在了。

瞬時表達分析檢測未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達。因此，表達水平與位臵無關(guān)，不會受到周圍染色體元件的影響。瞬時表達分析所需的人力和時間比穩(wěn)定表達少，但因為DNA攝入效率和表達水平在不同實驗中差異較大，實驗必須很小心。

為了進行穩(wěn)定表達，轉(zhuǎn)入的基因必須能和細胞同步復制。在轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒自發(fā)整合到宿主基因組上時就會如此。在一小部分轉(zhuǎn)染的細胞中，加入的DNA通過重組整合到基因組上。包含整合DNA的細胞很少，必須通過對藥物的抗性篩選進行擴增或通過表型變化進行鑒定。

穩(wěn)定基因表達實驗需要數(shù)周，如果需要驗證蛋白產(chǎn)量，所需的時間更長，但得到的細胞系可以做為蛋白生產(chǎn)的穩(wěn)定來源或用于得到轉(zhuǎn)基因動物。

08

瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測

基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率。

可以使用報告基因來確定優(yōu)化條件，其表達蛋白易檢測，在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP），熒光素酶（Lux或Luc）以及b- 半乳糖苷酶（b-gal）?？梢允褂煤唵蔚姆峭凰胤椒z測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMV SPORT- bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因，轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。

09

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的篩選

連同帶有藥物抗性的篩選標記基因一起轉(zhuǎn)染目的基因是建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系zui常用的方法。氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（APH或neor）可以合成APH酶，通過磷酸化使藥物失活，從而提供對GENETCIN選擇性抗生素（G418 Sulfate）的抗性。抗生素抗性基因可以與目的基因在同一個質(zhì)粒上，也可以在不同的質(zhì)粒上。如果兩個不同的質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染，兩個質(zhì)粒都可能整合形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。對于兩種不同質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，帶有目的基因的質(zhì)粒和帶有篩選標記的質(zhì)粒間的比例為3:1或更高以保證抗性克隆帶有轉(zhuǎn)染的目的基因。

陽離子脂質(zhì)體試劑提供了一種建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的高效方法。瞬時轉(zhuǎn)染效率的改進一般也會提高穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率。比如，使用LIPOFECTAMINE PLUS試劑得到的NIH 3T3細胞GENETICIN抗生素抗性克隆的數(shù)目比單獨使用LIPOFECTAMINE增加了大約3倍。要進行穩(wěn)定的表達分析，在轉(zhuǎn)染后次培養(yǎng)細胞，低密度鋪板，給予生長空間，在幾天或數(shù)周內(nèi)保持篩選壓力。

生長的細胞比不分裂的細胞更快的受到GENETICIN抗生素的影響。轉(zhuǎn)染后，在開始篩選前等待48-72小時，使細胞表達足夠量的抗性酶，保證在開始篩選時可以自我保護。轉(zhuǎn)染后48-72小時倒掉培養(yǎng)基，加入含有GENETICIN抗生素的培養(yǎng)基，抗生素的濃度根據(jù)劑量反應曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細胞。因為許多因子影響到篩選所需的GENETICIN抗生素的最佳濃度，包括細胞類型，培養(yǎng)基和血清濃度等，所以有必要對每種細胞作一個劑量反應曲線，確定最佳濃度。

篩選最多可能需要一周時間，因為在致死劑量的GENETICIN抗生素存在條件下，細胞會分裂1-2次。在次培養(yǎng)細胞時使用較低劑量的抗生素，一般是篩選劑量的一半。篩選后的細胞一般是離散的克隆，根據(jù)實驗目的不同，可以分別純化（克?。?，收集進行大量培養(yǎng)或染色并進行抗性克隆的計數(shù)。

10

蛋白表達和培養(yǎng)基的選擇

哺乳動物細胞系合成可溶的，翻譯后修飾的蛋白，比細菌，真菌或昆蟲細胞中表達的蛋白更有可能有生物活性。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可以合成大量的重組蛋白，而瞬時轉(zhuǎn)染細胞可以快速表達，迅速地合成小量蛋白。常用的細胞系包括CHO，293和COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F，293-H，COS-7和CHO-S細胞，來源于經(jīng)篩選轉(zhuǎn)染效率更高的亞細胞系。這些細胞也可用于無血清和限定化學成分培養(yǎng)基。重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)一般在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的懸浮細胞中進行。這些細胞易于生長到高密度并合成更多蛋白，使用基質(zhì)珠做為固相支持可以使貼壁細胞懸浮生長。

用于蛋白生產(chǎn)的細胞的轉(zhuǎn)染可以在添加有血清或無血清培養(yǎng)基中進行。但更傾向于使用無血清培養(yǎng)基表達蛋白，因為血清蛋白會干擾下游表達蛋白的純化。無血清培養(yǎng)基一般針對某一特定細胞類型優(yōu)化并有幾類無血清培養(yǎng)基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培養(yǎng)基低得多）。

無蛋白培養(yǎng)基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物，限定化學成分的培養(yǎng)基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇zuishihe您應用的一種。

在含血清時轉(zhuǎn)染的細胞可以適應無血清培養(yǎng)基，無蛋白培養(yǎng)基或限定化學成分的培養(yǎng)基。在部分情況下（如293-F，293-H，COS-7和CHO-S），對于已適應無血清或無蛋白培養(yǎng)基的細胞，可以使用其培養(yǎng)基進行轉(zhuǎn)染。其他一些無血清培養(yǎng)基包含抑制陰離子脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染的成分，在這些情況下，有必要在諸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染。

11

轉(zhuǎn)染效率的驗證

1、較有效的驗證方式必須是qPCR驗證；

2、熒光觀察，使用病毒轉(zhuǎn)染，明白自己病毒的情況，是熒光標記（一般是GFP）還是非熒光標記。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，可以在載體上添加熒光標記，幫助自己通過熒光觀察轉(zhuǎn)染效率。但是熒光并不能*證明轉(zhuǎn)染效率，還是通過核酸驗證最為準確。